體外分子診斷技術(shù)常見于感染、腫瘤、遺傳病等需要明確病因的場(chǎng)景。其中熒光定量PCR(qPCR)因低成本、短耗時(shí)、裝機(jī)量大的特點(diǎn)非常適合快速轉(zhuǎn)化和臨床推廣，然而大部分qPCR儀只能提供4～6個(gè)檢測(cè)通道，與質(zhì)譜、NGS等相比單次反應(yīng)覆蓋的靶標(biāo)范圍有所欠缺。超多重qPCR方法的技術(shù)革新彌補(bǔ)了這方面的不足，從而大為豐富qPCR的應(yīng)用場(chǎng)景。以病原檢測(cè)為例，超多重聯(lián)檢既能滿足患者擴(kuò)大排查范圍的需要，也可以為初檢陰性或經(jīng)驗(yàn)性治療無(wú)效的患者提供及時(shí)、全面的復(fù)測(cè)。

　　在多重qPCR方面，閱爾基因進(jìn)行了大量探索工作，比如基于多色編碼組合的Color-Mix策略、可用于RNA病毒分型的caPCR系統(tǒng)等等。近日，閱爾基因聯(lián)合復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院、同濟(jì)大學(xué)附屬肺科醫(yī)院，在經(jīng)典的國(guó)際權(quán)威期刊《Nucleic Acids Research》(IF=16.6)發(fā)表了CCMA(Color Cycle Multiplex Amplification)超多重?cái)U(kuò)增技術(shù)1，利用同一靶標(biāo)多個(gè)擴(kuò)增子之間可控的Ct延遲設(shè)計(jì)多色編碼組合，單管qPCR反應(yīng)即可鑒定21種常見病原體。理論上，僅需4個(gè)熒光通道可實(shí)現(xiàn)136重檢測(cè)。針對(duì)全血、痰液、肺泡灌洗液等復(fù)雜樣本的臨床驗(yàn)證結(jié)果顯示，CCMA的靈敏度和特異性分別為89%和100%，有潛力作為臨床快速篩查病原感染的新型診斷工具。

　　超多重qPCR技術(shù)有諸多實(shí)現(xiàn)思路，但需要解決的核心問題是一致的。首先，有限的熒光通道數(shù)量與數(shù)倍甚至數(shù)十倍的通量需求相悖，如何提高判讀條件的維度十分關(guān)鍵。其次，體系中過(guò)多的引物探針種類可能帶來(lái)不穩(wěn)定擴(kuò)增現(xiàn)象，比如非特異性擴(kuò)增、引物二聚體、不均一的擴(kuò)增效率等等。接下來(lái)，我們從這兩方面來(lái)看該領(lǐng)域現(xiàn)有方案的設(shè)計(jì)思路以及CCMA的創(chuàng)新之處。

　　信號(hào)解耦

　　從qPCR儀讀取到的擴(kuò)增曲線、溶解曲線、終點(diǎn)熒光值等信息，需要進(jìn)行轉(zhuǎn)換和計(jì)算并對(duì)應(yīng)到唯一的檢測(cè)結(jié)果。主流技術(shù)大致可分為以下三類：

　　第一類技術(shù)利用微流控等工程手段將qPCR反應(yīng)分配到不同腔室或模塊以增加多重性，也是最為直接的實(shí)現(xiàn)方式，代表性產(chǎn)品包括生物梅里埃的FirmArray 、凱杰的QiaStat-Dx以及賽沛的GeneXpert。這類方法的優(yōu)點(diǎn)在于將樣本前處理和后續(xù)數(shù)據(jù)分析集成到一套POCT設(shè)備中，然而設(shè)備耗材往往價(jià)格昂貴，并且出于有限的樣本濃度以及制造成本考慮，重?cái)?shù)通?？刂圃?0-20之間。

　　第二類技術(shù)使用不同熒光編碼組合來(lái)區(qū)分多個(gè)靶標(biāo)，最大通量與熒光通道呈指數(shù)增長(zhǎng)關(guān)系。比如一臺(tái)4通道儀器可以做到單管15重(2?-1)，閱爾基因開發(fā)的Color-Mix2技術(shù)、以及部分?jǐn)?shù)字PCR平臺(tái)均支持這種設(shè)計(jì)。單純的多色編碼難以應(yīng)對(duì)多靶標(biāo)共存的情況，因此ddPCR需要精確控制探針濃度(熒光強(qiáng)度)以增加判定維度3。Park等人提出的LiNC PCR技術(shù)則完全依靠熒光強(qiáng)度進(jìn)行區(qū)分，這是通過(guò)在多重連接探針兩端設(shè)計(jì)數(shù)量不等的熒光探針結(jié)合位點(diǎn)來(lái)實(shí)現(xiàn)的?。更多的探針結(jié)合位賦予了LiNC PCR更強(qiáng)的多重能力，但也降低了PCR效率，并且系統(tǒng)性靈敏度受限于初始的連接反應(yīng)效率。

　　第三類技術(shù)依賴于高分辨率溶解曲線(HRM)，并且能夠與不同熒光標(biāo)記的探針形成數(shù)量可觀的判讀組合，檢測(cè)通量在20～60重左右。市場(chǎng)上已經(jīng)有一些基于HRM的診斷試劑產(chǎn)品。這類方法流程方便，但實(shí)驗(yàn)操作條件要求較高，如單個(gè)堿基突變時(shí)熔解溫度差異很小，此時(shí)對(duì)qPCR儀的溫度分辨率和溫度均一性就有很高的要求。同時(shí)該方法對(duì)變異的容忍度較低，探針結(jié)合區(qū)域的錯(cuò)配堿基可能導(dǎo)致溶解曲線大幅偏移?。此外，隨著探針數(shù)目增加，較高的背景信號(hào)也限制了其最低檢測(cè)下限。這些問題的存在限制了HRM的臨床推廣。

　　另外還有一些免擴(kuò)增方法，比如基于編碼微球的流式熒光技術(shù)，基于磁共振的T2MR技術(shù)，它們?cè)谕可暇哂酗@著優(yōu)勢(shì)，但另一方面也高度依賴于特殊儀器和耗材。

　　圖1 CCM的設(shè)計(jì)原理

　　CCMA技術(shù)是首個(gè)僅需借助常規(guī)qPCR儀即可實(shí)現(xiàn)超指數(shù)級(jí)多重且可定量檢測(cè)的技術(shù)。其核心原理是：為每個(gè)靶標(biāo)設(shè)計(jì)多個(gè)擴(kuò)增子，在不同熒光通道的擴(kuò)增曲線之間引入可編程的Ct值延遲，進(jìn)而根據(jù)熒光出現(xiàn)順序識(shí)別不同靶標(biāo)(圖1)。比如2個(gè)熒光通道(G和R)最多可以鑒別4個(gè)靶標(biāo)。熒光通道數(shù)(F)和可控Ct延遲數(shù)(T)決定了CCMA的多重性：

　　可控的Ct延遲是CCMA工作的基礎(chǔ)，這一特性是通過(guò)抑制探針置換擴(kuò)增(BDA)原理實(shí)現(xiàn)的。Blocker抑制能力越強(qiáng)，熒光信號(hào)起峰的時(shí)間就會(huì)越晚。通過(guò)熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)可以精確調(diào)節(jié)擴(kuò)增曲線的相對(duì)關(guān)系，并且無(wú)Blocker擴(kuò)增子的Ct值可以作為定量結(jié)果(圖2)。

　　圖2 CCM的實(shí)現(xiàn)方法

　　針對(duì)樣本中可能存在多個(gè)靶標(biāo)的問題，雙管、雙擴(kuò)增曲線(T=2)的CCMA策略可以區(qū)分任意單一或成對(duì)靶標(biāo)。以血流感染(BSI)為例，其中約89.3%的病例為單一感染源，復(fù)合感染以兩種致病菌的情況居多，雙管CCMA檢測(cè)可以覆蓋約98.6%的病例。

　　多重?cái)U(kuò)增

　　超多重qPCR的另一個(gè)難點(diǎn)來(lái)自于引物二聚體和非特異性擴(kuò)增的干擾。為了彌補(bǔ)單條引物濃度下降帶來(lái)的擴(kuò)增效率降低，多重?cái)U(kuò)增體系通常會(huì)增加循環(huán)數(shù)和退火延伸時(shí)間，這也加劇了二聚體甚至多聚體的形成。

　　目前主流的抑制二聚體的思路包括1)設(shè)計(jì)具有特殊結(jié)構(gòu)的引物;2)使用UDG酶、Cas9或基于片段大小的純化方法去除二聚體;3)利用算法優(yōu)化引物設(shè)計(jì)。前兩種策略一定程度增加了試劑成本或產(chǎn)物損失。第三種策略則對(duì)引物設(shè)計(jì)有著更嚴(yán)格的要求，然而主流算法中很少專門針對(duì)引物二聚體進(jìn)行深度優(yōu)化。閱爾基因聯(lián)合上海肺科醫(yī)院開發(fā)的二聚體似然估計(jì)的模擬退火設(shè)計(jì)(SADDLE)算法，能夠進(jìn)行多重PCR引物的全自動(dòng)化設(shè)計(jì)和迭代優(yōu)化，在大型panel中實(shí)現(xiàn)了超低的引物二聚體水平?。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)顯示，384-plex panel(768條引物)的引物二聚體比例僅為1%。

　　圖3 SADDLE算法的基本流程

　　借助SADDLE算法設(shè)計(jì)21聯(lián)病原體檢測(cè)試劑盒(63-plex panel)并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行NGS分析，證明了CCMA體系極低的脫靶率和引物二聚體水平。即使在高濃度人源gDNA干擾的情況下，目標(biāo)擴(kuò)增子的reads占比也明顯高于脫靶擴(kuò)增reads。進(jìn)一步，將病原體檢測(cè)panel與168-plex非病原微生物panel混合后，CCMA的檢測(cè)結(jié)果依然不受影響，并且沒有出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增(假陽(yáng)性)的情況。這證明了CCMA具備模塊化設(shè)計(jì)的能力，SADDLE算法的正交優(yōu)化能力降低了不同體系設(shè)計(jì)中引物互作的風(fēng)險(xiǎn)。

　　圖4 基于CCM檢測(cè)21種病原體的qPCR panel設(shè)計(jì)

　　起始量在5～1800拷貝之間時(shí)，63-plex panel檢測(cè)各個(gè)靶標(biāo)DNA的相鄰擴(kuò)增曲線之間的Ct延遲(ΔCt)中位值分別為2.30和3.65，并且始終不低于0.9，證明CCMA良好的擴(kuò)增穩(wěn)定性。理論上，BDA探針可以實(shí)現(xiàn)小于3且可復(fù)現(xiàn)的ΔCt，從而允許設(shè)置更多編碼組合，比如兩通道體系將Ct延遲數(shù)(T)從2增加到3時(shí)可以將編碼組合從4種提高到6種。另一方面，反應(yīng)速率可調(diào)性也為平衡各個(gè)擴(kuò)增子之間的PCR效率提供了較為直接的途徑。

　　最低檢測(cè)限(LoD)方面，在30拷貝及以上水平，CCMA成功檢出所有21個(gè)病原體的DNA模擬樣本，并且其中12個(gè)病原體(如李斯特菌)的LoD低至5拷貝。

　　定量準(zhǔn)確性方面，以100拷貝起始量對(duì)21種病原體進(jìn)行三次重復(fù)定量，中位標(biāo)準(zhǔn)差分別為0.18、0.25和0.31。回歸分析顯示標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定系數(shù)(R2)在0.994至0.999之間。此外，不同試劑批次、操作人員和時(shí)間點(diǎn)的重復(fù)實(shí)驗(yàn)證明了CCMA的定量可重復(fù)性，首位Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差為0.25，相當(dāng)于不到20%的起始量變化。

　　總之，CCMA多重?zé)晒舛矿w系的主要特點(diǎn)可以總結(jié)如下：

　　以BDA原理為基礎(chǔ)的可編程熒光編碼系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了超指數(shù)級(jí)多重PCR

　　SADDLE算法降低了引物二聚體的產(chǎn)生，保證了擴(kuò)增體系的穩(wěn)定性和特異性

　　使用常規(guī)qPCR儀進(jìn)行檢測(cè)，引物探針的類型和修飾與常規(guī)Taqman熒光定量法一致

　　LoD和定量能力與常規(guī)qPCR一致，可檢測(cè)低至5～30拷貝的靶標(biāo)分子

　　最低僅需200uL全血即可一次排查21種常見病原菌

　　可以容忍模板序列上一定程度的單堿基多態(tài)性

　　耐受模板中高濃度的宿主核酸

　　除了成本和速度上的優(yōu)勢(shì)以外，超多重性將為qPCR檢測(cè)方案拓展更廣闊的應(yīng)用前景。特別地，超多重qPCR的可定量性對(duì)于臨床端的價(jià)值不容忽視，尤其在病原檢測(cè)方面，可以幫助醫(yī)生判斷感染程度以及感染源的主次關(guān)系。CCMA技術(shù)在呼吸道疾病、血流感染等領(lǐng)域已經(jīng)初步展現(xiàn)出臨床應(yīng)用價(jià)值，集成化且模塊化的設(shè)計(jì)流程以及靈活的體系優(yōu)化方式為開發(fā)更多高可用性的超多重qPCR病原檢測(cè)產(chǎn)品提供了平臺(tái)。

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